【学术快报】邹鹏课题组合作发展基于“生物正交工程”的远红区膜电位探针

作为神经系统信息交流的“通货”，神经电活动是大脑处理复杂信息的物理基础。与膜片钳和微电极阵列记录等基于电极材料的传统电生理技术相比，荧光膜电位成像在时空分辨率、测量通量等方面具有明显的优势。其中，发射波长在远红区（640 nm以上）的荧光探针由于其红移的光谱具有更强组织穿透能力，而且可适于多通路成像观测，因而备受研究人员青睐。然而目前可使用的远红区膜电位探针在亮度和灵敏度方面存在严重缺陷，因此亟需发展适用于记录神经元动作电位的高性能荧光探针。

2021年4月15日，北京大学化学与分子工程学院、北京大学麦戈文脑科学研究所邹鹏课题组与北京大学化学与分子工程学院陈鹏课题组共同在Nature Chemistry杂志在线发表了他们最新的研究成果“A far-red hybrid voltage indicator enabled by bioorthogonal engineering of rhodopsin on live neurons”，他们综合利用生物正交反应和膜蛋白工程化改造策略，开发出一系列具有高灵敏度和成像信噪比的荧光膜电位探针HVI（hybrid voltage indicator）。根据成像光谱需求，HVI的蛋白质骨架可借助生物正交反应搭配不同的荧光染料结构，构建出一系列跨越可见光谱的复合型探针。其中，橙红区探针HVI-Cy3具有最高的灵敏度，能够以高达90的信噪比成像记录神经动作电位；远红区探针HVI-Cy5具有最红移的光谱，不仅可与绿色或红色荧光探针同时使用，实现膜电位与钙离子、神经递质等重要生理信号的并行观测，还能够与光遗传学工具联用，实现全光学神经电生理检测。

图1 复合型膜电位探针HVI检测神经元膜电位概念图

邹鹏课题组长期致力于发展和应用化学探针技术，研究参与神经信号转导过程的生物大分子、支配神经活动的化学和物理信号。他们率先提出“复合型膜电位探针”的概念，利用化学手段将荧光染料与视紫红质蛋白相偶联，利用后者的电致变色效应实现膜电位成像（Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57, 3949-3953）。陈鹏课题组长期致力于发展适用于活细胞及活体动物的生物正交反应，并通过遗传编码技术，实现了蛋白质的特异标记、激活与调控（Nat. Chem. Biol. 2016, 12, 129-137）。在最新的研究成果中，两个课题组合作，将化学反应策略与蛋白质骨架改造相结合，对神经元的膜蛋白进行了原位的“生物正交”工程优化。一方面，鉴于目前大多数生物正交反应难以高效地标记膜蛋白，以及点击化学反应（铜催化炔基-叠氮环加成反应）对神经元的毒性，他们改用了生物相容性更好、效率更高的逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应（IEDDA），将高荧光量子产率的远红区染料引入工程改造的视紫红质蛋白的特异位点。另一方面，他们针对视紫红质蛋白Ace2中的关键质子受体氨基酸残基进行突变筛选，最终得到了消除稳态光电流且亮度及灵敏度显著提升的远红区复合型探针HVI-Cy5。当神经元膜电势发生去极化时，质子电化学势的改变促进视黄醛席夫碱的质子化，从而改变视紫红质的吸收光谱，最终通过FRET效应影响其偶联荧光染料的量子产率，导致荧光信号变化（图2）。

图2 复合型膜电位探针HVI荧光标记方法示意图及探针响应细胞膜电位变化原理图

实验表明，HVI-Cy5可与光遗传学工具联用（图3）。研究人员用短波长光单向或者双向调控神经元兴奋性，同时在远红区荧光通道记录膜电位变化，扩充了全光学电生理学工具箱（图3a-c）。该技术相比于传统的多电极膜片钳刺激并记录，技术难度明显下降。HVI-Cy5还可以与其他荧光探针进行双色成像，无串扰监测细胞膜电势及钙离子、递质和pH等生理信号（图3d-f）。多色成像将帮助研究者更好地了解膜电位与其他生理信号动态变化的联系和差异。

图3 具有深红荧光光谱的HVI-Cy5可与光遗传学工具及钙探针联用实现全光学电生理检测

此外，实验将HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在培养的大鼠海马体神经元中，利用膜电位成像评估APV和NBQX两种药物对神经元突触连接的影响，解析了NMDAR和AMPAR两类谷氨酸受体对突触信号传递的贡献（图4）。未来，HVI-Cy5有望在体外筛选作用于受体蛋白的激动剂或拮抗剂。

图4 将HVI-Cy5与光遗传学工具分别表达在不同神经元中可以研究药物对神经突触的作用

总之，本文通过对视紫红质膜蛋白的“生物正交”工程优化，发展了适用于神经元电信号记录的远红区高性能荧光探针HVI-Cy5，实现多色成像和全光学电生理学应用，期待该探针能够帮助研究者解读更加复杂的神经元电生理信号。

输

北京大学化学与分子工程学院博士研究生刘书彰、林畅，北大-清华生命联合中心博士毕业生胥永显（现浙江大学医学中心博士后）为该论文的共同第一作者。北京大学化学与分子工程学院、北京大学麦戈文脑科学研究所邹鹏研究员和北京大学化学与分子工程学院陈鹏教授为该论文的共同通讯作者。

专家点评

蒋华良（中国科学院院士，中科院上海药物所）

生物正交反应是指能够在活细胞等生理环境下进行，并且不与生命过程相互干扰的一类化学反应。作为化学家为生命科学研究开发的关键技术之一，这类反应已经被广泛地应用于从基础研究到药物研发、临床检测等领域当中，改变了生命科学和医学的研究进程。例如，基于生物正交反应的生物大分子特异标记，可以在活细胞内实时观察生物大分子的动态行为和功能变化。尤其是通过生物正交反应与荧光成像技术的联合使用，很多具有优异性质的荧光染料可被用来对生物大分子进行活体、动态、超分辨观测，推动了生物成像技术的进步。然而，由于神经细胞比普通的细胞更加脆弱，很多生物正交反应在神经细胞上依然表现出毒性，生物相容度差。此外，生物正交反应也普遍存在对膜蛋白标记效率偏低的问题。

北京大学邹鹏课题组一直致力于构建“荧光染料-传感蛋白”复合型膜电位探针，并用于观测神经活动中的化学和物理信号。陈鹏课题组长期致力于生物正交反应的开发和种类拓展。在这一工作中，两个课题组合作利用“逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应”，在神经元表面对“质子泵”膜蛋白-视紫红质进行定点、特异标记，进而构建出一系列具有高灵敏度和成像信噪比的荧光膜电位探针，实现了在远红区检测神经元动作电位。

狄尔斯-阿尔德反应是由狄尔斯(Diels)与阿尔德(Alder)这一对师生于1927年报道的一种发生在富电子双烯体和缺电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应，一经报道即吸引了众多研究者的兴趣，也为两位发现者赢得了1950年的诺贝尔化学奖。与之相反，发生在缺电子双烯体和富电子亲双烯体之间的[4+2]环加成反应被称为“逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应(Inverse Electron Demand Diels-Alder reaction, IEDDA)”。由于缺电子双烯体通常含有杂原子，而反应产物又为六元环，因此IEDDA常被用于合成含有杂原子六元环的天然产物。近年来，随着生物正交反应的兴起，狄尔斯-阿尔德反应再次受到了人们的关注，尤其是基于环张力的反式环辛烯亲双烯体与四嗪化合物（双烯体）可在生物兼容条件下发生极为快速、高效的偶联反应，开启了IEDDA作为生物正交反应的研究热潮。陈鹏课题组则于2014年将IEDDA反应拓展为化学脱笼反应，实现了蛋白质的原位激活，推动了“生物正交剪切反应”的兴起与发展。

在这一最新的进展中，两个课题组通过系统的比较，证明IEDDA反应是与神经细胞最为兼容的生物正交反应，能够实现膜蛋白的高效、特异和无干扰标记；与之相比，包括铜催化和无铜催化的点击化学反应在内的其他生物正交反应都表现出毒性高、信噪比差等问题。最终，通过IEDDA的“生物正交”优化改造，一系列跨越可见光谱的复合型荧光探针HVI（hybrid voltage indicator）得以构建，为“全光学电生理检测”提供了有力的工具。

长期以来，化学家们都在不断开发和利用条件温和、高效专一的化学反应，以期在活体环境下对生物大分子进行修饰和标记，对生命过程进行检测和调控。上述工作是这一不懈努力的又一重要进展，为在活细胞及活体动物内开展生命科学尤其是神经科学研究提供了关键技术，也为生物正交反应开拓了新的应用前沿。

李毓龙（北京大学，教授）、董辉（博士后）

膜电位是生命活动中一种至关重要的生物物理信号，而高时空分辨率、低损伤性记录脑神经元膜电位变化的技术手段可以帮助我们深入理解大脑的工作机制。近日，北京大学邹鹏和陈鹏课题组合作，结合化学生物学技术和蛋白质工程开发出了新一代复合型荧光膜电位探针（Hybrid Voltage Indicators, HVIs），实现了对神经元活动的高时空分辨率成像记录，相关结果发表在《Nature Chemistry》。邹鹏课题组在膜电位探针领域深耕多年，于2014年开发了一系列基于视紫红质Archaerhodopsin的可遗传编码膜电位探针（Genetically Encoded Voltage Indicators, GEVIs）。然而，目前常用的GEVIs亮度普遍较暗，需要使用高强度的激发光，因此容易造成光漂白并引发光毒性。与GEVIs相比，化学膜电位染料的荧光亮度和光稳定性较强，但其缺乏遗传编码特性，难以选择性地检测特定类型神经元的活动。2018年，邹鹏课题组结合GEVIs和化学膜电位染料的优势，通过生物正交和位点特异性标记方法将化学荧光团共价修饰在视紫红质Ace2上，开发出复合型膜电位探针。在最近的工作中，邹鹏课题组与陈鹏课题组强强联合，将目前最为高效的生物正交反应-“逆电子需求Diels-Alder反应”应用于神经细胞上视紫红质蛋白的特异化学标记，进一步提升了HVIs的性能。新一代HVIs直接将荧光基团连接到Ace2蛋白质骨架上，避免了过去铜催化click反应中重金属试剂造成的细胞毒性。与GEVIs相比，新一代HVIs不仅信噪比更高，还可通过连接不同的荧光团，便捷地拓展探针的成像光谱。发射光在远红区波段的HVI-Cy5，可与使用短波长激发光的其它分子工具如CheRiff等光遗传元件、iGluSnFR等神经递质探针、以及GCaMP6s和R-GECO等钙探针联合使用，体现了HVI-Cy5良好的光谱兼容性。该探针适用于全光学电生理学（All-optical electrophysiology），可推动神经生物学问题研究。希望新一代HVIs未来能够进一步实现在体应用，结合包括我们开发的神经递质荧光探针在内的工具，更好地促进我们对大脑工作秘密的解码。

原文链接：

https://doi.org/10.1038/s41557-021-00641-1

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研究组介绍

邹鹏

北京大学化学与分子工程学院研究员

北京大学麦戈文脑科学研究所PI

实验室研究兴趣：

本课题组致力于发展新型化学探针技术，为神经科学的研究提供新工具、新方法。我们一方面综合运用蛋白质工程、分子生物学和有机合成等手段创造新的功能分子，例如各类荧光探针、具有生物分子标记功能的酶及活性底物等；另一方面，结合光学、质谱、高通量测序等仪器技术，利用这些工具观测神经细胞的结构与活性，并通过数学建模对数据进行定量分析。目前的研究方向包括：（1）发展可遗传编码的荧光膜电位探针，实现对神经细胞动作电位的高时空分辨观测；（2）研究与神经退行性疾病相关的RNA颗粒的结构与功能；（3）发展蛋白质标记技术，研究参与记忆形成过程的局部蛋白质合成途径。

实验室主页：http://www.zoulab.org

北京大学IDG麦戈文脑科学研究所

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